UE transdisciplinaire - Physique


Imagerie calcique - Visualisation de l'influx nerveux


Benoît C. FORGET

2015-2016

Laboratoire neurophotonique
UFR des Scicences Fondamentales et Biomédicales
benoit.forget@parisdescartes.fr


activité de cellules neuronales progénitrices

Calcium : indicateur de l'activité

Microscopie à fluorescence

Plan

  1. Microscopie à fluorescence : Rappels
    • Microscope : Rappels d'optique géométrique
    • Fluorescence
    • De l'image à la mesure quantitative : Où ? , Combien ?, Quand ?
  2. Où ? : Notion de résolution spatiale
    • Nature ondulatoire de la lumière
    • L'expérience de fentes d'Young
    • Un peu (un tout petit peu) de maths : la décomposition en séries de Fourier
    • La limite de résolution
  3. Combien ? : Compter les photons
    • Un peu (un tout petit peu) de mécanique quantique
    • Fluctuations aléatoires : Rapport signal sur bruit
    • Statistique de Poisson
  4. Quand ? : résolution temporelle

Qu’est ce qu’un microscope?

Instrument qui:

  • donne une image grossie d’un petit objet (grossisement)
  • sépare les détails de celui-ci sur l’image (résolution)
  • rend les détails visibles à l’œil ou avec une caméra

Excellent site sur la microscopie en général : Nikon microscopy U

Qu’est ce qu’un microscope?

Instrument qui:

  • donne une image grossie d’un petit objet (grossisement)
  • sépare les détails de celui-ci sur l’image (résolution)
  • rend les détails visibles à l’œil ou avec une caméra

Formation d'image

  • le système est stigmatique pour les points \(A\) et \(A'\) ;
  • \(A'\) est le point conjugué du point \(A\) : \(A'\) est l'image \(A\) ;
  • tout rayon lumineux dont le support dans le milieu incident passe par \(A'\) a son support dans le milieu émergeant passant par \(A'\) ;
  • en l'absence de stigmatisme, l'image est floue

image nette

On cherche une relation bijective entre l' "objet" et l' "image" : pouvoir retrouver l' "objet" à partir de l' "image"

Optique géométrique

  • rayon lumineux pour étudier la propagation de la lumière et la formation d'images ;
  • lois empiriques de propagation rectiligne, de réflexion et réfraction ;
  • permet la conception d'instruments (eg. télescope, microscope, fibres optiques ...)

Wall painting from the Stanzino delle Matematiche in the Galleria degli Uffizi (Florence, Italy). Painted by Giulio Parigi (1571-1635) in the years 1599-1600.

Microscope Zeiss, circa 1879, d'autres de la même époque ici : Museum optischer Instrumente

Dioptres

Rélexion et Réfraction : A l'interface entre deux milieux d'indice de réfraction différents, le rayon "change de direction".

Snell - Descartes


  • Réflexion : $$ i = -r $$

  • Réfraction : $$ n_1 \sin i_1 = n_2 \sin i_2 $$

  • Conditions de Gauss : $$ \sin i \approx i $$

  • Retour inverse de la lumière

Mais que regarde Venus ?

Véronese 1585 : Vénus au miroir

lentille mince

Relation de conjugaison

$$ \frac{1}{\overline{OA'}}-\frac{1}{\overline{OA}}=\frac{1}{\overline{OF'}} \left(=-\frac{1}{\overline{OF}} \right) $$

Notion de foyer

Le foyer est le point conjugué de l'infini

Même les systèmes complexes ont un seul foyer objet et un seul foyer image

Grandissement transverse

$$ \gamma_t = \frac{\overline{A'B'}}{\overline{AB}}=\frac{\overline{OA'}}{\overline{OA}}$$

montage afocal

$$ \gamma_t = \frac{\overline{A'B'}}{\overline{AB}}=-\frac{\overline{O_2F_2'}}{\overline{O_1F_1'}}$$

loupe et grossissement angulaire

Microscope composé

La configuration "corrigée à l'infini" est la plus couramment utilisée.

Objectif

Qu’est ce qu’un microscope?

Instrument qui:

  • donne une image grossie d’un petit objet (grossisement)
  • sépare les détails de celui-ci sur l’image (résolution)
  • rend les détails visibles à l’œil ou avec une caméra

le grossisement ne suffit pas

Nature ondulatoire de la lumière

Microtubules de cellules S2 de drosophile

Suite la semaine prochaine ...

Qu’est ce qu’un microscope?

Instrument qui:

  • donne une image grossie d’un petit objet (grossisement)
  • sépare les détails de celui-ci sur l’image (résolution)
  • rend les détails visibles à l’œil ou avec une caméra

Fluorite

Principe de la fluorescence

Spectres moléculaires

Cas d'une molécule diatomique stable : il existe un minimum du potentiel d’interaction entre deux atomes

: Lennard-Jones potential

Remarque : L'oscillateur harmonique

Tout système à l'équilibre peut-être (en première approximation) décrit par un potentiel parabolique :

Oscillateur harmonique

Quantification de l'énergie
  1. Niveaux électroniques:
    • Niveaux électroniques : niveau fondamental, niveaux excités, transitions entre niveaux (comme dans l’atome d’hydrogène).
    • Transitions possibles dans le visible ou l’UV (1 à 10 eV) entre deux niveaux
  2. Énergie de vibration :
    • Fond du puits de potentiel : approximation harmonique $$E_n = h\nu(n+1/2)\; \textrm{avec}\; \nu^2 = k/m$$
    • Transitions possibles dans l’IR (0.1 eV) entre deux niveaux.
  3. Énergie de rotation
    • Spectre de rotation \(E_r = J(J+1)\) I : moment d’inertie de la molécule
    • Transitions possibles dans le domaine µ-ondes (0.001 eV) entre deux niveaux

Déplacement de Stokes

eg. Rhodamine 6g

Énergie d'un photon : $$ E = \frac{hc}{\lambda} = h\nu $$

: Stokes shift

cube

Voir des biomolécules en fluorescence

En général, les molécules biologiques (protéines, acides ne sont pas fluorescentes dans le visible (quelques exceptions: flavines, NADH, protéines fluorescentes,…). Certains acides aminés ont néanmoins des propriétés de fluorescence dans l’UV (tryptophane).

On attache spécifiquement des marqueurs fluorescents :

  • couplage covalent (liaison chimique)
  • marquage d’affinité: on utilise une molécule fluorescente qui vient s’attacher spécifiquement (anticorps, toxines,…)
  • clonage d’une protéine fluorescente

GFP

: GFP

GFP modifiée

GCaMP

Où ?

résolution spatiale

Microtubules de cellules S2 de drosophile

Optique ondulatoire


Qu'est-ce qu'une onde ?

Dans un milieu élastique il existe des forces internes qui tendent à le ramener à sa situation d'équilibre après une perturbation

Cette perturbation (ou déformation) se déplace à une vitesse (célérité) qui est déterminée uniquement par les propriétés mécaniques de ce milieu.

Mathematical description of waves

A deformation moving while keeping the same shape



Space and time evolution (variables) are 'coupled':
$$\xi(x,t) = \xi(x-ct) \qquad\left\{\xi(x+ct)\;\textrm{if}\; \vec c= -c \vec u_x \right\}$$

From a mathematical point of view

Is there an equation that allows for solution : $$A\xi(x-ct)+B\xi(x+ct)$$


d'Alembert equation ! $$\frac{\partial^2 \xi}{\partial t^2} - c^2 \frac{\partial^2 \xi}{\partial x^2} =0 $$

Transport d'énergie sans transport de matière

Fonctions trigonométriques

Trig functions (sine, cosine) are solution to d'Alembert's equation.

In the form : $$\xi(x,t)= A\cos(kx \pm \omega t+ \phi ) $$ with : \(\displaystyle c=\frac{\omega}{k}\)

Space (\(\lambda\)) and time (\(T\)) periodicity are explicited : $$\cos\left(2\pi\left(\frac{x}{\lambda} \pm \frac{t}{T}\right)+ \phi \right )$$ $$k=\frac{2\pi}{\lambda} \; ; \; \omega = 2\pi f = \frac{2\pi}{T} \quad\to \quad c=f\lambda$$

Notation complexe


The EM field \(E(x,t)\)is written in complex notation : \begin{align*} E=A\cos(kx \pm \omega t + \phi) & = \Re\left\{\tilde E = Ae ^{j(kx \pm \omega t + \phi)}\right\} \\ & = \Re\left\{\tilde E = Ae ^{j\phi}e ^{j(kx \pm \omega t)}\right\} \\ & = \Re\left\{\tilde E =\tilde Ae ^{j(kx \pm \omega t)}\right\} \end{align*}


Note: Physical (measurable) quantites can only be expressed with real numbers.

The traveling wave

$$\tilde{E}=\tilde{A}e^{j( \omega t \pm kr)}$$

For example, a sound wave : $$f=1000\,{\rm Hz} \; ;\; c=330\,{\rm m.s^{-1}} \quad\to\; \lambda = 0,33\,\textrm{m}$$

$$e^{j(\omega t - kx)}$$
$$e^{j(\omega t + kx)}$$

Optical Waves

Visible light waves have "very high" frequency :

$$ c=3\times 10^8 {\rm m/s} \qquad 400 {\rm nm} < \lambda < 700 {\rm nm} $$ $$ f= \frac{3\times 10^8 {\rm m/s}}{500\times 10^{-9} {\rm m}} = 6\times 10^{14} {\rm Hz} $$
detector response time
eye \( \approx 0,1\) s
photo film \( \approx 10^{-4} - 10^{-2} \) s
single electronic detector \( \approx 10^{-6} - 10^{-2}\) s
CCD \( \approx 10^{-2}\) s

Filtrage des fréquences spatiales

L'expérience de fentes d'Young

Abbe's theory of image formation

$$ d=\frac{\lambda}{2n\sin \alpha}$$

An image is a spatial distribution of intensity, the intensity of the total field reaching the image plane

This total field can be expressed as the sum of individual fields and the image can "viewed" as the interference pattern genrated by these individual fileds !

Fourier series

Any periodic function \(f(t)\) of period \(T\) (pulsation \(\omega\), \(\omega T=2\pi\)) can be expressed as :
\begin{align*} f(t) &= a_0 + a_1\sin\omega t + b_1 \cos\omega t + a_2\sin 2\omega t + b_2 \cos 2\omega t + \ldots \\\ &= a_0 + \sum_n a_n \sin n\omega t + \sum_n b_n \cos n\omega t \end{align*}


Abbe's diffraction limit

PSF


Définitions de la résolution

Il en existe plusieurs :

  1. L'inverse de la fréquence spatiale maximale : $$ \frac{1}{k_{max}}=\frac{1}{2 ON / \lambda} = \frac{\lambda}{2 ON}$$
  2. La largeur à mi-hauteur (FWHM) de la PSF : $$ \approx \frac{0,353 \lambda}{ON} $$
  3. Le critère de Rayleigh : $$ \frac{1,22 \lambda}{2 ON} = \frac{0,61 \lambda}{NA}$$

Tache d'Airy

$$E(\theta) = E_0 \left ( \frac{2 J_1(ka \sin \theta)}{ka \sin \theta} \right )^2$$
$$k = \frac{2\pi}{ON}$$

Notion de convolution ...


Convolution, filtrage, traitement d'image

... et de déconvolution

Illumination
structurée

Moiré



Modulation d'amplitude

En 1D :

$$\cos(2\pi f_0 x) \times \cos(2\pi f_1 x) = \frac{1}{2}\left[\cos(2\pi (f_1-f_0) x)+\cos(2\pi (f_1+f_0) x)\right]$$

En 3D :

Microscopie HiLo

Emiliano Ronzitti



Résolution axiale

Microscopie confocale

microscopie à onde évanescente : TIRF

microscopie bi-photonique

Combien ?

mesure quantitative et RSB

Nombre de photons

nombre de photons par unité de temps (seconde):


$$ n_i = \frac{\textrm{Énergie par unité de temps}}{\textrm{Énergie par photon}} = \frac{I}{hc/\lambda} $$

Système fluorescent à deux niveau

\begin{align} k_{des}&=k_r+k_{nr} \\ k_r&=\frac{1}{T_{fluo}}\\ k_{exc}&=\sigma\frac{\lambda}{hc}I \end{align}

Dynamique des populations

\begin{align} \frac{dP_e}{dt} &= -k_{des}P_e+k_{exc}P_g \\ P_e+P_g &=1 \end{align}

Solution à l'état stationnaire : $$ \frac{dP_e}{dt} =0 \quad\to\quad k_{des}P_e =k_{exc}P_g$$

Taux de fluorescence : $$ \Gamma = k_r P_e = \frac{1}{T_{fluo}}P_e$$

\begin{align} k_{des}P_e &=k_{exc}P_g \\ P_e &= \frac{k_{exc}}{(k_r+k_{nr})}(1-P_e) \\ &= \frac{k_{exc}}{(k_r+k_{nr})+k_{exc}} \end{align}
\begin{align} \Gamma&=\frac{1}{T_{fluo}}P_e &=\frac{1}{T_{fluo}}\frac{\frac{k_{exc}}{k_r+k_{nr}}}{1+\frac{k_{exc}}{k_r+k_{nr}}} \end{align}

$$ \frac{k_{exc}}{k_r+k_{nr}} = \frac{\sigma\frac{\lambda}{hc}}{k_r+k_{nr}} I = \frac{I}{I_s} \quad\to\quad I_s=(k_r+k_{nr})\frac{hc}{\sigma\lambda}$$

Saturation de la fluorescence

$$\Gamma=\frac{1}{T_{fluo}}\frac{I/I_s}{1+I/I_s}$$
  • Régime linéaire : \(\displaystyle \Gamma = \frac{k_r}{k_r+k_{nr}}\frac{\sigma\lambda}{hc} I\)
  • Régime saturé : \(\displaystyle \Gamma = \frac{1}{T_{fluo}}\)

mesure et RSB

$$ \frac{S}{\sigma_b} >> 1$$

  • \(\sigma_b\) est l'écart-type de la distribution des fluctuations
  • \(\sigma_b^2\) est la variance de la distribution des fluctuations

Sources de bruit

  • Bruit électronique (bruit de lecture, courant d'obscurité, ...)
    indépendant de l'intensité lumineuse
  • Signal optique parasite (autofluorescence, lumière diffusée, ...)
    proportionnel de l'intensité lumineuse
  • Fluctuations intrinsèque (bruit de photon ou "shot noise")
    proportionnel de l'intensité lumineuse

Comme ces mécanismes sont indépendants : $$ \sigma^2=\sigma_{elec}^2+\sigma_{par}^2+\sigma_{shot}^2$$


Si on peut "minimiser" les sources de signal parasite et le bruit électronique, le bruit de photons correspond à des fluctuations dues à la nature quantique de la lumière
Une mesure "au bruit de photon" est une mesure "idéale".

Loi de Poisson

Loi de probabilité discrète décrivant le nombre d'évènements survenant pendant un laps de temps, si ces évènements :


  • se produisant avec une fréquence moyenne connue
  • indépendants du temps écoulé depuis l’évènement précédent
$$ P(X=k)=e^{-\lambda}\frac{\lambda^k}{k!}$$

  • \(\lambda\) est est un nombre positif
  • Pour étudier pendant \(N\) minutes des évènement se produisant en moyenne \(n\) fois par minutes : $$ \lambda = N\times n $$

Espérance

\begin{eqnarray*} E\{X\}&=&\sum_{k=1}^{k=\infty}kP(X=k) \\ &=& \sum_{k=1}^{k=\infty}ke^{-\lambda}\frac{\lambda^k}{k!} \\ &=&e^{-\lambda}\sum_{k=1}^{k=\infty}\frac{\lambda^k}{(k-1)!} \\ &=&\lambda e^{-\lambda}\sum_{k=1}^{k=\infty}\frac{\lambda^{k-1}}{(k-1)!} = \lambda e^{-\lambda} e^{\lambda} =\lambda \end{eqnarray*}

Variance

\begin{eqnarray*} V\{X\} = E\{X^2\}-(E\{X\})^2 &=& \sum_{k=1}^{k=\infty}k^2P(X=k) -\lambda^2 \\ &=& \sum_{k=1}^{k=\infty}k^2e^{-\lambda}\frac{\lambda^k}{k!} -\lambda^2 \\ &=& \lambda e^{-\lambda}\sum_{k=1}^{k=\infty}k\frac{\lambda^{(k-1)}}{(k-1)!} -\lambda^2 \\ &=& \lambda e^{-\lambda}\sum_{k=1}^{k=\infty} \frac{d}{d\lambda}\left[\frac{\lambda^k}{(k-1)!}\right] -\lambda^2 \\ \end{eqnarray*}
\begin{eqnarray*} V\{X\} &=& \lambda e^{-\lambda}\sum_{k=1}^{k=\infty} \frac{d}{d\lambda}\left[\frac{\lambda^k}{(k-1)!}\right] -\lambda^2 \\ &=& \lambda e^{-\lambda} \frac{d}{d\lambda}\left[\lambda \sum_{k=1}^{k=\infty} \frac{\lambda^{(k-1)}}{(k-1)!}\right] -\lambda^2 \\ &=& \lambda e^{-\lambda} \frac{d}{d\lambda}\left[\lambda e^\lambda \right] -\lambda^2 = \lambda e^{-\lambda} (\lambda + 1) e^\lambda -\lambda^2 =\lambda \end{eqnarray*}

Loi de Poisson - Loi normale

$$ P(X=k)=e^{-\lambda}\frac{\lambda^k}{k!} \approx \frac{1}{\sqrt{2\pi\lambda}}\exp\left(-\frac{(k-\lambda)^2}{2\lambda}\right)$$

Pistes futures

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